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  • 液相色譜柱損耗率高?五大維護關鍵問題必看!

      色譜柱技術始于1950年代。隨著填料和填料技術的發展,色譜柱技術越來越成熟,其功能也越來越完善。已廣泛應用于生命科學、環保、材料、食品、藥物開發等領域。


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      液相色譜柱在色譜分析系統中主要起分離被檢物質的作用,作為色譜系統的心臟,也是一種消耗品。為了減少損失,色譜柱的維護非常重要!


      液相色譜柱使用中常見的問題包括柱子連接、柱子活化、柱子使用、柱子維護、柱子存放等。


      01


      立柱連接


      立柱安裝方向


      色譜柱安裝應按同一方向連接,需按照色譜柱上的方向指示連接,盡量避免色譜柱接反!


      常見的色譜柱連接有兩個主要問題。色譜柱安裝時,延長管接頭長度過長,使螺紋變淺,導致密封不良和泄漏,進一步造成基線漂移或響應降低;反之,管道前段會出現死體積,導致峰形變寬,靈敏度降低。


      理想的接頭連接應具有以下特點:管道與界面之間無死體積;始終避免在超高壓和高溫下泄漏;優異的長期穩定性,防止管道滑動;使用方便。


      管道的選擇也很重要。分析液相系統常用的規格是內徑為0.12和0.17mm的管道。更換管道時,首先確認當前管道規格,更換內徑和長度相同的管道,否則更換前后的結果會不一致,因為管道的體積會影響柱外體積系統,從而影響峰形和保留時間。


      02


      反相柱活化平衡


      1)首先,用甲醇或乙腈洗滌大約20個柱體積。


      2)如果流動相含有緩沖鹽,使用與流動相中初始比例相同比例的超純水和有機相沖洗過渡液約20次柱體積,然后平衡并用含有緩沖鹽的流動相沖洗大約柱體積的20倍或更多。


      3)如果流動相不含緩沖鹽,可以直接用流動相平衡柱子,大約柱體積的20倍或更多。


      4)當基線和壓力穩定后,根據連續注射結果的再現測試確定平衡是否完全平衡。如果不夠,可以延長流動相的平衡時間。


      03


      反相柱沖洗并保存


      1)用50:50甲醇或乙腈與水的混合溶液沖洗20-30倍柱體積;


      


      2)用純甲醇或乙腈沖洗20-30倍柱體積;


      3)存放前將柱端接頭上的塞子密封嚴密,以防止填料變干。


      04


      反相柱清洗和再生


      清洗或反沖反相色譜柱時,用至少30倍柱體積的下列溶劑沖洗色譜柱:


      將色譜柱與檢測器斷開,留出色譜柱末端的管線,放入接液的燒杯中,用不含緩沖鹽的流動相(水/有機相)沖洗,然后用100%有機相(甲醇和乙腈)檢查壓力是否恢復正常。如果沒有,請繼續下一步。


      如果壓力沒有恢復正常,丟棄色譜柱或考慮使用更強的條件進行清潔:75%乙腈/25%異丙醇、100%異丙醇、100%二氯甲烷、100%己烷。


      值得注意的是,無論使用正己烷還是二氯甲烷,使用前或恢復使用反相流動相前都必須用異丙醇沖洗。


      關于色譜柱反吹


      盡管色譜柱不應輕易反吹,但當明確知道超壓是由顆粒堵塞篩板或柱頭污染補救措施引起時,反吹是有效的。反吹色譜柱可以快速沖洗掉顆粒物。此外,它可以快速沖出柱頂以強力吸附污染物。反吹后,色譜柱仍處于正向連接狀態。但是,反吹也會帶來負面影響。例如,它可能會導致柱床松動、保留時間的變化以及小粒徑色譜柱的反吹可能會導致填充流動。等待。


      其中,可反吹的色譜柱包括:粒徑大于2um(2.7、3、3.5、4、5μm等)的色譜柱;不能反吹的色譜柱有:粒徑小于2um的色譜柱(1.8μmRRHD/RRHT;1.9μmPoroshell)。


      05


      色譜柱使用中的常見問題


      液相色譜柱使用中常見的問題包括pH值、溫度、溶劑耐受性、壓力、樣品等。色譜柱的使用條件不應超過制造商推薦的范圍,包括壓力、pH范圍、水相耐受性、柱溫等。當測試條件接近色譜柱使用范圍的極限值時,色譜柱生活會受到影響。


      01


      如何調節C18柱的pH和溫度來提高分離度?


      答:通過調節pH和柱溫來優化分離度是方法開發中非常重要的方法。簡而言之,中性或不可電離的化合物對pH值的變化不敏感。對于可離子化的化合物,可以通過調節流動相的pH值和控制化合物的電離狀態來改變化合物的反相保留。降低pH會增加酸性化合物的保留,而增加pH會增加堿性化合物的保留。調整pH值以改變化合物保留并優化組分之間的分離。


      通常提高柱溫會加速傳質并降低保留,但不同化合物的保留對溫度變化很敏感,因此也可以通過調整柱溫和改變各組分的保留時間來優化分離。


      02


      塔總超壓的原因是什么?


      回答:過壓通常是由包括色譜柱在內的液體流路堵塞引起的。需要進行分段排查,確定阻塞位置,然后根據阻塞位置排查阻塞的可能原因。


      如果色譜柱堵塞,常見的原因有很多,如樣品臟、基質復雜、前處理不好,或前處理后進入液相系統沉淀出來,造成堵塞或污染(解決方法:加強樣品前處理);由超壓或使用超出色譜柱的pH范圍引起填料碎裂,色譜柱被雜物顆粒堵塞(解決方法:根據試驗條件選擇合適的色譜柱,避免超量程使用);儀器使用過程中零件磨損造成的堵塞(解決方法:及時更換損壞的零件)等,會造成系統柱壓力升高。


      03


      C18柱晚峰時間有什么影響?高峰時間延遲一段時間后。是否與流動相有關?


      答:液相色譜中影響化合物保留的主要因素包括:樣品、色譜柱、流動相(流速、組成、比例等)、柱溫等,如果在使用過程中發現保留時間漂移,則必須可以從以下幾個因素進行調查:可以先檢查相同條件下的壓力曲線是否出現保留時間漂移前后的現象,以便初步調查可能的原因。如果壓力曲線沒有再次出現,首先確認試驗條件是否發生變化,檢查流動相的流速、組成、比例等是否發生了變化,是否有因泄漏引起的流速和比例的變化或氣泡;對流動相組成變化敏感的樣品和方法應保證每次制備的流動相的重現性;檢查色譜柱是否堵塞或污染;儀器的溫度控制是否準確等等,可能的原因有很多,具體的原因還需要進一步調查。


      04


      我應該使用什么流動相來存放色譜柱?用純有機試劑容易干燥嗎?


      答:反相柱可以存放在HPLC級甲醇或乙腈中,注意插緊塞子。一般情況下,只要把塞子堵好,溶劑就不容易干。當然,在存儲溶劑中加入5%-10%的水是沒有問題的。


      05


      乙腈流動相總是容易聚合,有什么解決辦法嗎?


      答:乙腈的聚合需要一定的條件和時間,所以一定要使用質量可靠的HPLC級溶劑,并保證所用溶劑盡可能新鮮。如果是長期存放的乙腈溶劑,使用前過濾會有所改善。


      06


      小分子極性物質一般使用哪種液相色譜柱?


      答:可以先嘗試使用能容忍高比例水相的柱,增加流動相水比以增強保留。如果是可離子化的化合物,例如酸性或堿性化合物,可以先嘗試通過在反相模式下調節流動相的pH值來增加保留。酸性化合物需要降低流動相的pH值,堿性化合物會增加流動相的pH值,具體取決于pH條件。選擇可以承受的柱子。如果調整pH值后反相模式的保留仍然很弱,也可以考慮使用其他保留模式的色譜柱,如HILIC柱、HILIC-Z、HILIC-OH5或純硅膠HILIC柱等,或使用離子交換色譜柱或正相色譜等。


      07


      柱分離效果差怎么辦?


      答:色譜柱分辨率下降的主要原因是色譜柱效率的降低和色譜柱選擇性的變化。柱效降低的原因有很多。如果由于連接不當導致柱效損失,只需重新正確連接即可。如果色譜柱在使用過程中由于色譜柱污染導致柱效降低或由于選擇性變化導致分辨率降低,可以嘗試清洗和再生色譜柱。如果是色譜柱本身損壞造成的,分離變化通常是不可逆的。只能更換色譜柱,使用新色譜柱時盡量避免各種損壞色譜柱的操作。


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